2008年5月,西双版纳,徘徊着一个失意的年轻人。风光旖旎,但这位年轻人在考虑是否要放弃他已经做了4年之久的非人灵长类研究工作,重新选择他的方向。

从追赶到领跑:体细胞克隆猴技术的十年
——记中科院神经科学所体细胞克隆猴团队

他叫孙强,那一年,他还只是被华东师范大学派驻到西双版纳一个小猴厂里,开展非人灵长类研究的一名讲师。

■本报见习记者 任芳言 记者 陈欢欢

在中国这样一个科技比较后发的国家当中,无论科研院校还是企业,都更偏好一些短平快的研究,花个三五年,砸上几十万,发几篇高质量论文,上可告慰领导,下能忽悠风投,美滋滋。而研究猴子就是典型的反例。研究猴子吧,啥都慢,就是烧钱快,最不受人待见,堪称是生命科学这个大坑中的马里亚纳海沟。而孙强却选择了蹲在这沟里。

2018年1月,两只克隆小猴“中中”和“华华”登上国际期刊《细胞》,成了举世瞩目的大明星。这是世界首例非人灵长类动物的体细胞克隆。它们的诞生意味着以体细胞克隆猴为实验动物模型的时代就此开启。

放弃非人灵长类研究并不是因为他的科研能力。在学术界,要说起克隆猴【注】,那可真是一把辛酸泪。早在2003年,来自剑桥大学、麻省理工大学等众多科研院校的数名顶尖专家就在《科学》杂志发表评论,给克隆猴技术“判了个死刑”——政府并不需要严防死守克隆人,因为“大自然已经对(克隆灵长类)设置了障碍”,灵长类的卵细胞有着极为独特的生化特性,凭现有技术是无法克隆的\[1\]

一年后,“中中”“华华”又有了5个“兄弟”。它们作为世界首例生物节律紊乱的体细胞克隆猴模型出现在我国顶级期刊《国家科学评论》上,再次成为焦点。

一声绝望的呐喊。

“这一成果意味着中国正式开启了批量、标准化创建疾病克隆猴模型的新时代,对加快新药研发等有重要意义。”中科院神经科学研究所所长、中科院院士蒲慕明说。

时间似乎印证了专家的看法,自2003年之后,虽然时不时还有一些“不怕死”的去挑战克隆猴难题,但收效甚微。而2008年,孙强的研究也仅仅是建立了非人灵长类辅助生殖技术,得到了试管猴,他想再进一步获得转基因猴的这个梦想似乎无法进行下去了。

用蒲慕明的话说,这样重大的科研成果,其实是靠一支“精锐小团队”攻关出来的。

必威官网,孙强的麻烦还不止于此,他还有个非常糟糕的头衔——没有海外经历的博士,俗称土博士。在没留过洋都不好意思跟人打招呼的中国学术圈子里,土博士基本就在鄙视链的最底层。在国内,一个没有特别重大成果的土博士想拿个终身教职简直难于上青天,在这样的环境下,孙强甚至有失业的风险。

“中中”和“华华”的诞生凝聚了神经所苏州灵长类研究平台整个研究团队的精力和神经所的多年支持,起名字的过程却很迅速。

然而人生的诡谲之处,就在于哪怕天时地利人和全部负分,机会依然有可能降临。

为确保克隆猴成果是国际首例,在两只小猴顺利成长数日后,团队负责人孙强和主要成员刘真仍不敢松懈,忙着处理数据、准备投稿。赶文章间隙他们向蒲慕明请教,给这两只小猴起什么名字好?

孙强的机会,来自千里之外。

“要不你们一人起一个,叫‘强强’和‘真真’?”蒲慕明看了看二人,孙强和刘真连连摇头。蒲慕明又想了一下,说道:“‘中中’和‘华华’如何?”众人齐声说好。

虽千万人吾往矣

同样是2008年,在上海,中国科学院神经科学研究所的所长蒲慕明做了一个艰难的决定——致力于开展以非人灵长类为主要模式动物的研究,并着手筹建非人灵长类研究平台。为什么说这是一个艰难的决定呢?因为当时做非人灵长类模式动物构建的成熟方法还只有慢病毒介导的过表达转基因技术,基因编辑技术还在路上,更谈不上克隆猴技术这个天堑。这提议一出来,整个神经所都炸锅了!要知道,当时中国的神经科学才刚从一穷二白的状态走出来,你就要搞这种大新闻,这简直是拿科研经费开玩笑了。

但蒲慕明自有想法。对他而言,当初回国创建神经所,一干就是二十几年,他给神经所设定的目标可不止是在世界顶级期刊上发表几篇论文而已,他的目标,是推动中国成为一个真正意义上的科技强国,在神经科学领域领跑世界。他相信,非人灵长类研究就是那个突破口。

在中国,猕猴是国家二级保护动物,不过,相比而言,有能力拿猕猴做研究的专业科研人员才是真的“稀有动物”,简直可以算是“特级保护动物”。经过一番寻寻觅觅与机缘巧合,蒲慕明发现了孙强。

“你能把转基因猴子做出来吗?”蒲慕明就这一个问题。

“能。”

其实孙强这回答完全没有底气,老蒲也知道他没底气,但是天下大事岂是能等别人把路铺好了才去做的?

“尽管确定名字只用了几分钟,但后来想想,中华复兴的梦想在大家心里已经藏了很久。”神经所党委书记王燕总结道。

筚路蓝缕的猴平台创业史

要从头建立一个非人灵长类饲养和研究设施,不花个几年时间是无法完成的,为了快速启动非人灵长类研究,早日得到转基因猴,神经所和孙强毅然决定把猕猴平台安置在了某个猴子养殖场附近。然而,猴子方便了,却把人折腾得够呛。

我也曾经因为课题需要在神经所的猴平台待过一段时间。至今我还记得,当年有一次晚上睡觉的时候突然惊觉被窝里钻进了老鼠。然而孙强跟我说:“时下,平台的条件已经好多喽”。

条件还没“好多了”的时候得多惨?那就可想而知了。

猴平台位于一个非常非常偏远的乡下,出门就能拍摄《荒野求生》的那种偏远。平台人员想吃个饭还得骑电驴去几里外的镇上买菜回来自己做。平台刚建立的时候,那里连路灯都没有,一入夜就伸手不见五指。

必威官网 1猴平台出门看到的就是这样的景象。摄影:鬼谷藏龙

有一年下大雨,平台甚至还差一点被淹了。当时,平台工作人员全体出动“抗洪”,而神经所党委书记王燕担心人员出事,要求全员撤离。但是,人要跑了,猴子可就全完了。孙强最后的决定是,女人全部撤离,男人留下。好在没过几天雨停了,猴房终究没泡水。水刚退,所有撤离的人员就马上回去上班了。

如果说工作生活上的恶劣环境还能忍受,人手不足就很难熬了。尽管有两名熟练技术人员愿意从版纳跟随孙强而来,但在平台刚刚建立起来的时候,大部分人手都是几乎没有任何经验的“小白”——包括后来克隆猴项目的第一大功臣刘真,在当时也不过是个刚刚入学,对克隆技术一窍不通的研究生。但是课题不会停下来等他们,平台才成立,一个建立孤独症猴子模型的课题就紧锣密鼓地展开了。

在那种情况下,孙强只能自己捋起袖子上。

猴平台的团队一直给我一种拼命三郎的感觉,这估计跟孙强的表率作用颇有关系。有一次,实验前期准备已经做好,孙强却因为晚上太黑,骑电驴出事故摔断了锁骨,但是想到不做会白白浪费许多猴卵,就硬是悬着胳膊又撑着干了一个星期。等实验做完去医治的时候,摔断的锁骨已经错位愈合,不得不重新切断,再接上。即便如此,他还是掐着时间,等锁骨再度愈合便立即回归一线。

就是在这种玩命般的努力下,猴平台除了和神经所多个老师合作制取了多种灵长类模型,也自主完成了包括人工加速猕猴精子成熟等工作——这不仅让平台渡过了最早的危险期,也积累了不少经验,培养了一批能手。终于,平台可以着手准备挑战那个看似不可能的任务——克隆猴了。

而就在两只小猴出生的前几个月,体细胞克隆猴团队的成员刚遇上研究生涯中“最大的一次打击”。

蚕食出来的克隆猴项目

研究克隆技术是个需要长期积累的体力活。开发克隆技术别无他法,唯有海量尝试这一条路而已。从体外保存卵细胞的培养液配方,到用于显微操作的玻璃针的最佳尺寸,都是需要用卵细胞测试出来的。

对于小鼠、兔子之类特别能生的小动物来说,排的卵本来就特别多,还可以很轻松地实现成千上万只的大规模饲养,不愁卵的来源。而对于猪牛羊之类的大动物,事情就会更麻烦一些。熟悉凌晨四点的可远不止是科比,还有研究克隆技术的兽医们。凌晨四点是大部分养殖场屠宰牲畜的时间,兽医们早早的就得提着保温桶等候在养殖场门口,趁热从被抛弃的下水里把卵巢和输卵管分拣出来——这其中包含的成熟卵细胞就是一天工作的基本材料,孙强在回忆他当年读研参加克隆牛的项目就是这样的场景。

麻烦、辛苦,毕竟还有“海量尝试”的机会,然而到猴子面前,这些手段完全失效——猴子的成本实在是太高了。现代社会大规模饲养猴子的唯一合法目的就是科研,而且按照实验伦理,灵长类动物不可随意被处死。所以想要取卵,科学家需要给猴子注射促排卵的激素,等待猴子卵泡成熟后方能通过外科手术从卵巢中吸出十几颗卵。由于抗药性和手术损伤的问题,平均每只猴子一生只能取卵不到几次,平摊下来,每颗猴卵的成本超过一千元人民币,再怎么土豪也架不住那么成千上万地尝试。

好吧,其实这样的土豪也不是没有,世界克隆猴领域从前公认的第一高手——美国传奇科学家沙乌科莱特·米塔利波夫(Shoukhrat
Mitalipov),曾仗着家底殷实,一口气消耗了15000颗猴卵来尝试克隆猴\[4\]。但米塔利波夫最终也以失败告终,15000颗卵中活得最久的克隆胚胎,发育了81天后宣告流产\[4\]

孙强向来不赞成这种烧钱玩法。一方面是他真没这个钱,为了扶持这个灵长类平台,神经所所长蒲慕明用其有限的所长基金尽最大可能地给予支持。但即便如此,这些资金在“无底洞般”的克隆猴课题面前依旧经常捉襟见肘。

而另一方面他还觉得,米塔里波夫的豪赌赔进去的不止是金钱,更多的是信心的丧失——以人类的意志真的很难从这样的失败中走出来。他认为克隆猴应该是一场持久战,决不可指望毕其功于一役,毕竟技术一直在进步,但心态炸了可就全完了。

为此孙强的克隆猴实验长期都处于秘密研究的状态——我在猴平台工作的两年里始终都不知道任何相关的消息。主要是不想让外界知道他还把经历和经费用在这样一个被判了半个死刑的项目上,如此不但经费支持可能会受到威胁,单是外界的流言蜚语就难保会动摇整个平台的士气。

为了省钱,孙强和他的团队也是无所不用其极。除了买猴子总是拼命杀价以外,每次和其他人合作课题结束后剩下的猴子或猴卵,他们从不浪费,总是攒起来再摸几组参数,甚至有一段时间平台工作人员还轮流值日扫厕所,从清洁工的佣金里抠点钱出来。

用孙强的话说,整个克隆猴项目,就是这么常年零敲碎打,一点一点“蚕食”出来的,

为确保研究成功,研究团队尝试用猴卵丘细胞和猴胎儿成纤维细胞两种不同的体细胞做克隆。2017年夏天,利用猴卵丘细胞进行克隆的一组有两只胎儿发育超过130天,通过剖腹产手术出生但未能存活。

天下大事必作于细

所谓成大事者,不过就是把每一件小事都做好而已。

克隆首先是个手艺活。取卵、去核、注核,每一步都需要高超的实验技巧。经过长达数年的苦练,刘真已不再是对克隆技术一窍不通的“吴下阿蒙”,而是“国际最顶尖水平”的胚胎操作专家了——他的每一步操作都能精确到秒。对孙强来说,只有这样,每一次实验对参数的改进才算有效——刘真做出来好那肯定是真的好,不好就一定是真的不好,绝没有“发挥失常”的担忧。

这还是台面上的功夫,在一般人看不到的地方,还有更精妙的苦功夫。就比如,等月经。

克隆需要的猴卵必须从母猴体内获取,而要让母猴排卵就必须按照母猴的月经周期注射促排卵药物,可是……你咋知道猴子来大姨妈了呢?总不能让人满世界追着猴子看吧。于是平台工作人员练就了辨识猴脸的本事,他们认识猴房里的每一只猴子——数百只只猴子,不用看号牌就知道谁是谁。这还不算,他们还用尽各种办法跟母猴们搞好关系,从此只要打个招呼,母猴就会主动展示之。

如果说看月经还能和猴子打个配合,那还有些事就只能靠人类自己来掌握了。克隆的猴子往往会遇到难产的问题,需要剖腹产。但是剖腹产如果提前太多又容易让胎儿发育不良,最理想的做法就是猴子即将临盆的时候去给它做剖腹产。可是猴子跟人一样,预产期是很不准的,分娩时间飘忽不定。孙强便组织好几个饲养员,录了一大堆母猴生崽的视频,一有空就盯着看,寻找母猴临盆的迹象。最后他们还真的就总结了一套预警母猴分娩的窍门。

必威官网 2身怀绝技的猴平台工作人员(右下)和平台饲养的猴子们(上)。图片来源:中国科学院神经科学研究所。

为了防止出现半夜临盆的问题,他们会把快要生育的母猴安排到单独的病房里,有专人留守彻夜监控,随时准备把兽医从床上叫起来做手术。平台还设立了个制度,监控人员每隔30分钟就得在QQ上发个信息,以便事后检查监控人员有没有打瞌睡。

离成功仅一步之遥,几名团队成员心情无法平复,到太湖边上转了一圈,逼着自己调整心态。

机会属于永不放弃尝试的人

尽管技术每天都在进步,但你永远不知道时代的拐点何时才会到来,胜利的总是永不放弃尝试的人。

自从当年米塔里波夫雄心勃勃的计划失败以后,世界上还在尝试克隆猴的实验室已寥寥无几。不过灵长类的克隆难题一直吸引着许多科学家去探索,他们很想知道挡在克隆猴面前的无形壁障本质上究竟是什么。

而这其中,就包括哈佛大学的张毅教授。他在小鼠上的工作发现克隆效率低下的原因,和一种叫做“DNA甲基化”的现象密切相关,只要适当削弱“DNA甲基化”就能让克隆小鼠的效率大大提高\[5\]。不过张毅的专业并非克隆技术,他的理论也不过是世界上无数一家之言之一,对于猴平台而言,这项研究不过就是多了一样要测试的参数罢了。

因此,尽管张毅在2014年就已经发表了他的发现,但响应者寥寥,孙强与刘真他们在无数各种不同提升克隆效率方法的尝试失败后,也尝试重复一下张毅的发现。然而就是这一轮尝试,给克隆技术试出了一片新的天地——借助张毅的理论,克隆的各项指标都有了巨大的提升。

是时候放手一搏了。

2017年8月对猴平台来说是一段悲喜交加的时光。喜的是,那个月猴平台迎来了第一只克隆猴的降生;悲的是,这只克隆猴幼崽仅仅存活了三十多个小时便夭折了。一开始这事只有孙强,刘真和蔡毅君(平台一位技术员)知道。他们三个都特别沮丧。于是孙强开着车拉着他俩到太湖边上转了一圈,最后说:“米塔利波夫的最高纪录就怀了81天,我们的怀了一百多天,都可以出生了,不管怎么样我们已经是世界最领先了嘛。”

只剩下最后一步了。

在令人兴奋的压力中又过了两个月,喜讯传来——“中中”降生了!这一次,克隆猴幼崽活了下来。又过半个月,第二只克隆猴“华华”也降生了。

必威官网 3中中和华华近照。图片来源:中国科学院神经科学研究所|刘真。

当初,蒲慕明对孙强说,猴子孕期半年,米塔里波夫走完了一半,你把剩下的一半走完就好了。这剩下的一半路,一走就是九年。

几个月后,利用猴胎儿成纤维细胞进行克隆的一组中,有两只母猴正常怀孕超过140天并顺利诞下胎儿,这才有了前文给两只小猴起名的一幕。

新的起点

对孙强团队来说,尽管他们兑现了当初对蒲慕明的诺言,但是这对他而言不过是个新的开始。这个世界上还有无数人都盯着他这个曾经的无名小卒,想知道他究竟只是一时运气好中了个大奖还是真有什么过人之处。更别说,还有四面八方的风凉话,说国外只不过是因为伦理问题不能大量使用灵长类,所以才没做出克隆猴来。尽管,早在2010年,美国饲养的实验猴就超过了70000只\[2\]

天大的荣耀总是与天大的风险相伴随行。一直以来,克隆研究领域就像是受了“诅咒”,许多名动一时的先驱都在前进道路上栽了跟头。“中中”和“华华”的诞生不过只是一个开始,前行的路上,任何一步懈怠,都有前功尽弃的可能。对“土博士”领军的猴平台来说,单单团队建设就是个非常现实的问题。猴平台的工作人员与学生常年要在第一线奋斗,基本没有任何出国深造乃至提高学历的机会。评职称、涨工资总是处处掣肘,甚至是孙强自己都长期无法取得博士生导师资格——凭什么留住这些人才?

凭着克隆猴名动天下后,孙强给管理层提出的最“任性”的要求,就是破格提拔他的一干手下。这也是管理层的心声。面对破格提拔只有大专学历的猴房总管做副高级工程师的申请,神经所党委书记王燕对评审委员说,“你们就告诉我,她的能力够不够资格。如果够,学历的问题我来担。”

于是,在神经所,刘真和孙强一样,将有机会同时成为了有史以来从没有过的“土博士”研究员,博士生导师。

至少,这份力保人才的心与魄力,给猴平台团队的凝聚力提供了的坚实的保障。当初刘真毕业的时候曾经有机会出国深造,按照中国现有的制度,出国留学一圈回来就能直接做博导,而要是留着做土博士,万一克隆猴没做出来(当时也的确还看不到任何希望),没准一生都难有翻身的机会,然而刘真依然选择留了下来。如今,刘真理论上已经和孙强平起平坐,但他依旧还跟七年来一样,继续跟在孙强身后做克隆猴的研究。

没了后顾之忧,前进的道路上,就只剩下未知的挑战,和那熟悉的令人兴奋的压力了。

“中中”和“华华”的诞生意味着中国在克隆猴领域的科研终于领跑了世界。不过,偶尔超出半个身位可算不得什么领跑。不管是孙强、刘真,还是蒲慕明,他们想要的,是超出更多,更多,把别人甩得远远的。

克隆猴从零到一是最重要的突破,但是从一到二以至于无穷依旧是艰难的任务。作为中国脑计划\[6\]的一部分,克隆猴的出现,为人类探索自己颅腔中的这三磅宇宙,提供了新的“神器”。只是,现在的克隆猴技术还远不算成熟,在已经开启的新的征途上,猴平台团队还需要付出更多的努力。

也但愿,从这里开始,蒲慕明多年苦心孤诣的科技强国之梦,又能向前再迈进一小步吧。(编辑:明天)

【注】本文中所有的克隆全部指“核移植重编程技术”,分割胚胎之类的“克隆”不在讨论之列。

神经所苏州灵长类研究平台诞生于2009年。刚建成的那几年并不顺利,曾经历过几乎没有研究产出、几个人照看几百只猴子的艰难情况,甚至还有抗洪抢险的时候,所做的研究也面临着激烈的同行竞争。

参考资料:

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    rhesus monkey: opportunities and challenges. Cloning & Stem
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  2. Lankau, E. W., Turner, P. V., Mullan, R. J., &Galland, G. G. (2014).
    Use of nonhuman primates in research in North America. Journal of
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  3. Meng, L., Ely, J. J., Stouffer, R. L., & Wolf, D. P. (1997). Rhesus
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  4. Sparman, M. L., Tachibana, M., & Mitalipov, S. M. (2010). Cloning of
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  5. CHUNG, Young Gie, et al. Histone demethylase expression enhances
    human somatic cell nuclear transfer efficiency and promotes
    derivation of pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2015, 17.6:
    758-766.
  6. 蒲慕明, 徐波, 谭铁牛.脑科学与类脑研究概述[J]. 中国科学院院刊,
    2016, 31(7): 725-736

2012年,蒲慕明一锤定音,给研究平台定了一个新目标:开展非人灵长类体细胞核移植研究。

“这在当时是我们这一领域尚未解决的一大难题。”团队成员之一、神经所研究员刘真告诉《中国科学报》。

克隆需要把受体的卵细胞核取出,注入到异体体细胞核中。猴子作为灵长类动物,其细胞核更精细、更复杂,克隆起来也更困难,长期以来都不被看好。

团队研究产出不尽如人意,为何还要接下这块吃力不讨好的“硬骨头”?这其实是神经所布下的一盘“大棋”。

蒲慕明曾直言,发一篇顶级学术期刊文章不算重大科技突破。真正的重大突破应该是在原有领域中获得里程碑式的成果,或是开启创新的科研领域。“关键是能组织团队攻关,而不只是自由探索。体细胞克隆猴这个小团队,就是一个攻关的例子。”

要做世界第一并非易事。决定开展克隆猴研究后,团队成员更沉心静气,拿出多年积累下的真本事,一点点“蚕食”克隆难题。

孙强曾在云南西双版纳的山上待了将近4年研究试管猴,积累了宝贵经验。

刘真为训练自己的显微镜操作水平,曾一天6小时都坐在显微镜前,用小鼠胚胎做细胞去核的操作训练。大量练习后,刘真取卵注核的操作能精确到秒,显微镜的机械臂仿佛他自己的双手一般,一小时取50多个小鼠卵细胞如行云流水。

平台实验兽医主管王燕,练就了一身辨认猴子的本事:根据尾巴长短、体型、毛色、胡须,甚至眼睛大小分清每只猴子。每每进入猴房,猴群不但不躲开,反而会乖乖等她抓起尾巴检查,有些还会主动靠过来。

克隆动物常常会难产,平台兽医主管陆勇为在值班时保持清醒,坚持每30分钟发一条QQ到工作群,确保自己能监控到怀孕母猴的细微变化。

“科研人员要有紧迫感。”蒲慕明表示,体细胞克隆的难题“就是在紧迫感的环境下做出来的”。

因为团队成员的这股拼劲儿,原本计划于2020年攻破的体细胞克隆猴难题在2017年底就见到了胜利曙光。

苏州灵长类研究平台建成至今,团队从不到10名成员发展到如今的20余人、1000多只猴子,一直坚守的团队成员逐渐成长起来。这支团队也获得了2018中国科学院年度团队荣誉称号。

2009年,结束在西双版纳山上的“修行”后,孙强在距上海两小时车程的西山岛上扎下了根。为确保研究尽早开展,孙强以最快的速度选址、招人、租场地,让实验平台初具雏形;为节约启动资金,这里的日常交通工具就是电瓶车,实验室最早只有100多平方米;为尽快锻炼新人熟悉实验操作,他们甚至直接在办公室里养起了老鼠。

“我们想用较少的资源尽可能多地做事。”孙强说。

刘真刚到神经所时,还是孙强的一名硕士生,如今这名“土生土长”的博士没有选择出国,而是成为平台的一名课题组组长,开始独立做一些研究项目。

“神经所这个大平台的支持是一切的基础。”刘真告诉《中国科学报》,“我们只要踏踏实实做好手头的事情,这是很幸运的。”

10年间,王燕见证了整个平台的从无到有,从当年不曾踏出云南的小姑娘,变成了克隆猴辅助生殖实验领域的“牛人”——她的一台腹腔镜微创取卵移植手术可控制在20至30分钟内,一天最高手术纪录是11台,更不用说她多年来与猴子打交道积累下的经验。

对整个团队来说,掌握非人灵长类体细胞克隆技术只是开始。作为平台负责人,孙强表示,接下来的日子更要“耐住寂寞”。
“从猴子身上能找到的答案有很多,不是一两项实验就能完成的。现在的技术也有很多地方需要完善优化。”

“我们未来还有更大的攻坚问题,包括怎样使用克隆猴技术建立有用的疾病模型,怎样真正用在人类疾病治疗上。”蒲慕明表示。

《中国科学报》 (2019-04-09 第1版 要闻)

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